Comparação das técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento de região ITS-rDNA para análise filogenética de isolados de Colletotrichum spp.

Resumo

O gênero Colletotrichum é dos grupos fitopatogênicos mais importantes, principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A identificação das suas espécies é difícil, devido à grande variação morfológica intraespecífica. Métodos moleculares, como PCR-RFLP e o sequenciamento, têm ganhado destaque em estudos de filogenia deste fitopatógeno. Este trabalho objetivou comparar as técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento para análise filogenética entre isolados de Colletotrichum spp. Todos os isolados foram cultivados em meio Batata-Sacarose (BS), por uma semana a 24 oC. Inicialmente foi realizada a amplificação do rDNA, utilizando-se iniciadores ITS1 e ITS4. A seguir foi feita a digestão da região ITS utilizando enzimas de restrição (Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Xho I, Acc I, Eco RI e Taq I) e revelação em gel de agarose 2%. Obteve-se uma grande variação com produtos da clivagem, de 500 a 90 pb. Os fragmentos amplificados foram purificados com o kit QIAquick Gel Extraction Kit 250 e as amostras foram sequenciadas na região ITS do rDNA de todos os isolados. As sequências foram alinhadas no software ClustalW e a árvore filogenética foi construída no software Mega 3.1. Os produtos obtidos na amplificação da região ITS1- 5.8S-ITS2 do rDNA, com a utilização do par de iniciadores ITS1 e ITS4, revelaram um fragmento de aproximadamente 600 pb para todos os isolados analisados. A técnica PCR-RFLP não foi muito eficiente para a diferenciação das espécies de Colletotrichum spp, pois algumas das enzimas escolhidas tinham o seu sítio de clivagem em regiões conservadas, sobrepondo e mascarando os resultados. Já a técnica de sequenciamento possibilitou a separação dos isolados por espécies e hospedeiro e permitiu a comparação com os sequenciamentos dos bancos de genes. A técnica de PCR-RFLP deve ser utilizada atrelada à técnica de sequenciamento para se obter uma maior economia e veracidade dos resultados em estudos de filogenia de microorganismos.